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人肺腺癌细胞系A549细胞双向电泳飞行时间质谱研究

来源：中国论文下载中心作者：发布时间：2008-01-26

作者：杨拴盈，田应选，南岩东，卜丽娜，霍树芬，阮禹松商业街www.bizje.com

【摘要】 目的初步分析人肺腺癌细胞系A549细胞蛋白质表达情况，从蛋白组水平探讨肺腺癌发病的分子机制。方法应用2DE技术对人肺腺癌细胞系A549细胞总蛋白进行分离，获得蛋白质表达谱；应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)结合生物信息学进行蛋白质鉴定。结果 3块胶平均蛋白斑点数为1138±49，平均匹配点数为986±32，匹配率为85.8%。随机选取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量较高的20个斑点进行MALDITOFMS分析，共获得了18个肽质量指纹图谱(PMF)。将PMFs质量数据通过Aldente软件查询SWISSPROT数据库，根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率等，初步鉴定出15种蛋白质。根据功能，这些蛋白质可分为：①基本代谢相关的酶类：果糖2磷酸醛缩酶、视网醛脱氢酶1(RALDH1)、吡多醛激酶；②细胞骨架类：蛋白细胞角蛋白8(CK8)、β2链微管蛋白；③应激相关蛋白：蛋白二硫化物异构酶A3(PDIA3)；④ 信号转导分子：膜联蛋白1(ANX1)、膜联蛋白4(ANX4)；⑤分子伴侣：热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白β1、抑制素(PHB)；⑥转录及翻译相关蛋白：不均一性核糖核蛋白H(hnRNP H)；⑦杂类：Rgr protein、NPM、PCBP1。结论应用2DE/MALDIMS方法获得了较为理想的人肺腺癌细胞系A549细胞2DE蛋白质表达谱，初步鉴定了15种蛋白质。

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【关键词】 人肺腺癌细胞系；蛋白质组学；双向电泳；基质辅助激光解吸离子化电离飞行时间质谱；肽指纹图谱 www.Hueiu.com 会友网

　　A proteomic study on human lung adenocarcinoma　cell line A549 by 2DE and MALDITOFMS

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　　ABSTRACT: Objective To analyze protein profiles in human lung adenocarcinoma cell line A549 cell and to investigate molecular mechanism of pulmonary adenocarcinoma genesis at the level of proteomics. Methods Two dimensional gel electrophoresis (2DE) was used to separate totally soluble proteins extracted from A549 cell, and peptide mass fingerprintings (PMFs) were obtained and then some spots on 2DE gels were identified by matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS) combined with bioinformatics. Results The average total number of proteins spots was 1138±49, average paired spots 986±32, and matched rate 85.8% among the three gels. 20 spots with high resolution and reproducibility were analyzed using MALDITOFMS, 18 spots yielded PMFs, and 15 proteins were preliminarily identified and further classified into 7 categories based on their functions: ① enzymes related to cell metabolism: fructosebisphosphate aldolase A, retinal dehydrogenase 1(RALDH1), pyridoxal kinase; ② cytoskeleton proteins: type II cytoskeletal 8(CK8), tubulin beta2 chain; ③ proteins related to stress: protein disulfideisomerase A3 (PDIA3); ④ signal tranduction molecules: annexin A1(ANX1)and annexin A4(ANX2); ⑤ chaperones: 60ku heat shock protein(HSP60), heat shock protein beta1, prohibitin(PHB); ⑥ proteins related to transcription and translation: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H(hnRNP H); ⑦ others: Rgr protein, nucleophosmin(NPM), poly(rC)binding protein 1(PCBP1). Conclusion A clear, wellresolved protein profile in A549 cell was obtained by 2DE and 15 proteins were identified using PMFs. 大学城www.uniuc.com

　　KEY WORDS: human lung adenocarcinoma cell line; proteomics; two dimensional gel electrophoresis; matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS); peptide mass fingerprinting

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　　肺癌是目前全球范围内发病率最高的恶性肿瘤[1]，腺癌是肺癌中最主要的组织学类型之一。由于肺腺癌发病机制不明、转移早、对放疗及化疗不敏感，因此，已成为制约肺癌5年生存率的主要因素。近年来，由于蛋白质组学(proteomics)技术具有高通量、高重复性及高灵敏性等特点，能够从整体水平(蛋白)分析蛋白质的变化，故其已成为探讨肿瘤发病机制和筛选其早期诊断标志物的强有力工具[23]。在本研究中，我们应用双向电泳(two dimensional gel electrophoresis, 2DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry, MALDITOF MS)技术结合生物信息学方法，检测人肺腺癌细胞系A549细胞蛋白质的表达情况，旨在从蛋白水平探讨腺癌的发病机制。

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　　1 材料与方法 www.Hueiu.com 会友网

　　1.1 材料

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　　1.1.1 细胞人肺腺癌细胞系A549细胞引自西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所，用含10%(体积分数)小牛血清的RPMI1640培养液进行传代培养。一流导航www.16dh.com

　　1.1.2 主要仪器 UP 200s超声破碎仪(Dr.Hielscher GmbH)；Ultrospec 2100proUV/Visible Spectrometer (Amersham Bioscience)；IPGphor等电聚焦仪(Amersham Biosciences公司)；Hoefor SE600垂直电泳仪(Amersham Biosciences)；ScanMaker 8700 扫描仪(MICROTEC)；Model 250 pH计(Thermo Orion)；WR2001型溶剂过滤器(上海嘉鹏科技有限公司)；Milli Q超纯水发生器(Millipore)；VoyagerDETM MALDITOF质谱仪(Applied Biosystems)；CentriVap Concentrator(Labconco公司)；凝胶图像分析软件ImageMaster(Amersham Biosciences公司)；超速低温离心机(德国Sigma公司)；冷冻真空干燥机(美国Heto公司)。CO2细胞培养箱(REVCOELITE2)，倒置相差显微镜(NIKon/TMS)。商业街www.bizje.com

　　1.1.3 试剂尿素(Urea)、硫脲(thiourea)、三羟基甲基氨基甲烷碱(Trisbase)、EDTA、Protease Inhibitor Mix、CHAPS、TX100、十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)均购自Promega公司；溴酚蓝、甘氨酸、过硫酸铵均购自美国AMRESCO；丙烯酰胺(Arc)、甲叉双丙烯酰胺、碘乙酰胺(iodoacetamide)、硝酸银、蛋白质组学级(proteomics grade)TPCK胰蛋白酶(TPCKtrypsin)、胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)、基质α氰基4羟基肉桂酸(CHCA)均购自Sigma公司；低熔点琼脂糖、甲醇、冰乙酸、固相pH梯度干胶条(IPG strip, 13cm, pH3-10)、IPG缓冲液(pH3-10)均购自Amersham PharmaciaBiotech公司；低分子量标准蛋白质购自上海伯奥生物制品公司；甘油、碳酸氢铵等其余试剂均为国产分析纯；新生小牛血清购自杭州四季青有限公司，RPMI1640培养基购自GIBCO公司。所有溶液均用Milli Q水配制。商业街www.bizje.com

　　1.2 方法

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　　1.2.1 细胞总蛋白的提取用含10%(体积分数)小牛血清的RPMI1640培养基进行传代培养A549细胞。待细胞生长至对数生长期时，胰酶消化，室温1000r/min离心10min，弃上清，重复3次；将1×107个细胞重悬于100μL预冷裂解缓冲液(8mol/L urea， 40g/L CHAPS，40mmol/L Trisbase，65mmol/L DTT，0.5% Pharmalyte pH3-10，1mmol/L PMSF)中，在4℃静置30min；冰浴中超声破碎10s(每次5s，间隔5s)；4℃ 15000r/min离心20min，取上清；Bradford 法蛋白定量，分装，-80℃冻存备用。

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　　1.2.2 2DE 用13cm固定胶条(pH3-10)，上样量45μg。参照IPGphor等电聚焦系统指南进行。最大电流60μA/IPGstrip；水化和聚焦在20℃自动进行。总电压时间积30000Vh，最后在8000V下进行等电聚焦。将胶条进行两步平衡后，移至12.5%分离胶的上端，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)。电泳完成后，按蛋白质银染试剂盒的操作手册进行银染。

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　　1.2.3 凝胶图像分析图像扫描后，在ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件辅助下，进行背景消减、点检测、匹配、获取斑点位置坐标等分析。

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　　1.2.4 质谱分析对银染蛋白点进行胶内酶切，脱色，还原，烷基化，酶解(用 TPCK胰蛋白酶)、萃取及冻干，将制备好的样品置于VoyagerDE MALDITOF质谱仪上进行分析。采用线性模式、正离子谱测定，离子源加速电压为20kV，离子延迟提取500ns，质谱信号单次扫描累加50次，以多肽质量标准(ABI公司)为外标。

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　　1.2.5 肽质量指纹图谱的数据库查询将结果通过Aldente软件进行肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprintings, PMF)查询。数据库选择SWISSPROT，PMF中的肽片段质量控制在1000-5000，肽片段分子质量最大容许误差(Peptide tol.)控制在±0.5u，Enzyme选择胰酶，酶解片段不完全(missed cleavages)选择为1个，物种来源(taxonomy)选择人类，离子选择[M+H]+和平均(average)，固定修饰(fixed modifications)选择脲甲基半胱氨酸(carbamidomethylCys)。
　　
　　2 结果

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　　2.1 人肺腺癌细胞系A549细胞总蛋白的2DE图谱图1为A549细胞总蛋白的银染2DE图谱。在相同条件下，对A549细胞总蛋白进行了3次2DE检测。经图像扫描后，应用ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件对图像进行分析，结果显示3块胶的平均蛋白斑点数为1138±49，用其中1块胶作为参考胶进行匹配，平均匹配点数为986±32，匹配率为85.8%。

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　　图1 人肺腺癌细胞系A549细胞总蛋白双向电泳图谱（略）

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　　Fig.1 2DE gels of total protein extracts from human lung adenocarcinoma cell line A549 大学城www.uniuc.com

　　2.2 蛋白质斑点的MALDITOFMS分析从3块胶上匹配的蛋白点中随机选取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量较高、重复性较好的20个斑点进行质谱分析。共获得了18张PMF。图2是1号蛋白质点的PMF。

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　　2.3 数据库查询鉴定蛋白质对20个蛋白点进行MALDITOFMS分析。结果显示，大多数PMF图背景很低，峰信号较强，以1000-5000之间的片段峰较多。将PMFs质量数据通过Aldente软件查询SWISSPROT数据库，根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率，结合表观Mr及pI，初步鉴定出15种蛋白质(表1)。2个点未获得PMF，2个PMF未搜索到匹配的蛋白质。初步鉴定的15种蛋白质根据功能可分为：①基本代谢相关的酶类[fructosebisphosphate aldolase A(果糖2磷酸醛缩酶)，retinal dehydrogenase 1(RALDH1，视网醛脱氢酶1)，pyridoxal kinase(吡多醛激酶)]；②细胞骨架类蛋白[type II cytoskeletal 8(CK8，细胞角蛋白8)，tubulin beta2 chain(β2链微管蛋白)]；③应激相关蛋白[protein disulfideisomerase A3 (PDIA3，蛋白二硫化物异构酶A3)]；④信号转导分子[annexin A1(ANX1，膜联蛋白1)，annexin A4(ANX2，膜联蛋白2)]；⑤分子伴侣[60ku heat shock protein(HSP60，热休克蛋白60)，heat shock protein beta1(热休克蛋白β1)，prohibitin(PHB，抑制素)]；⑥转录及翻译相关蛋白[heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H(hnRNP H，不均一性核糖核蛋白H)]；⑦杂类[Rgr protein，nucleophosmin(NPM)，poly(rC)binding protein 1(PCBP1)]。 www.07job.com