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过氧化物酶增殖体激活受体γ2转基因小鼠的制作及其影响因素分析
来源：中国论文下载中心 作者： 发布时间：2008-01-26
作者：赵四海，楚雍烈，郑华东，杨鹏辉，陈正兰，朱虹，范江霖，刘恩岐 大学城www.uniuc.com
【摘要】 目的 分析影响转基因小鼠制作的因素，优化转基因动物制作过程，建立适合本实验室的转基因小鼠制作方法。方法 利用显微注射方法制作转基因小鼠，对超数排卵的程序、受精卵的收集、外源基因的显微注射、胚胎移植和术后护理等影响因素都进行了对比研究。结果 优化了转基因小鼠的制作过程，减少了影响胚胎移植成功的不利因素，提高了过氧化物酶增殖体激活受体γ2(PPARγ2)转基因小鼠的制作效率(2.9%)。结论 成功制作了PPARγ2转基因小鼠，优化转基因小鼠的制作程序是提高转基因成功率的可行途径。
【关键词】 过氧化物酶增殖体激活受体γ2；转基因；小鼠；影响因素
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转基因小鼠是生物医学研究中重要的动物模型[12]。1980年，Gordon等[3]首次利用显微注射方法成功制作转基因小鼠，开创了人类利用转基因动物模型的新纪元，此后各种转基因动物相继培育成功，在生物医学研究领域得到广泛的应用。到目前为止，Gordon等创立的将外源基因直接注射到受精卵雄原核中，进行胚胎移植，获得转基因动物的方法，仍然是目前制作转基因动物的主要方法之一。在本研究中，我们通过对过氧化物酶增殖体激活受体γ2(peroxisome proliferatoractivated receptor γ2, PPARγ2)转基因小鼠模型制作过程的影响因素进行分析，探讨提高转基因效率的可行途径，建立适合本实验室的转基因小鼠的制作方法。 商业街www.bizje.com
1 材料与方法 商业街www.bizje.com
1.1 实验动物
C57BL/6J小鼠由西安交通大学医学院实验动物中心提供。所有实验用小鼠均在标准动物房饲养，温度控制在(22±3)℃，光控(12h明/12h暗)，自由采食，Co60灭菌饲料由第四军医大学实验动物中心提供。 www.07job.com
1.2 试剂、药品和仪器
孕马血清(pregnant mare serum, PMS, 宁波激素厂)，人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG，宁波激素厂)，透明质酸酶(Sigma)，2×Taq PCR 试剂盒(北京天为时代)，蛋白酶K(Invitrogen)，M2和M16培养液(自制)。仪器：CO2培养箱(Shel lab)，P97拉针仪(Sutter)，MF900烧针仪(Narishige)体视显微镜(上海光学仪器厂)，显微注射系统(Eppendorf)，PCR 仪(ABI)，凝胶成像系统(Syngene)。 商业街www.bizje.com
1.3 转基因小鼠的制作方法[4] 一流导航www.16dh.com
采用显微注射方法，其制作流程如图1所示。 一流导航www.16dh.com
1.3.1 目的基因的构建 www.Hueiu.com 会友网
构建ap2+PPARγ2(cDNA)目的基因，克隆、扩增、纯化后备注射。
1.3.2 超数排卵和同期发情 www.Hueiu.com 会友网
PMS和hCG诱发供体雌鼠(donor)同期发情和超数排卵。在实验第1天腹腔注射PMS(0.5u/只)，46-48h后给供体鼠注射hCG(0.5u/只)，hCG注射当天(实验第3天)下午和雄鼠合笼，次日早晨6∶30-8∶00检查雌鼠有无阴栓来判定是否已经交配成功，交配成功的雌鼠阴道口可见白色的阴道栓。 www.Hueiu.com 会友网
1.3.3 受体鼠(recipient)的准备
实验开始前应该提前准备输精管结扎雄鼠，挑选至少两次和雌鼠交配后都不能使其受孕的结扎雄鼠备用。实验第3天下午挑选数只雌鼠和结扎雄鼠合笼，次日晨6∶30-8∶00检查雌鼠阴栓来判定是否已经交配，交配成功的雌鼠用来作为胚胎移植的受体鼠。
1.3.4 受精卵的收集 www.Hueiu.com 会友网
处死供体鼠，打开腹腔，取出输卵管(保留一小段子宫)。将输卵管置于M2培养液中，用小镊子撕开输卵管膨大部，可见有受精卵团溢出，用吸管将受精卵团转移至含有透明质酸酶的M2培养液滴中，吹吸数次，洗掉泡沫细胞[5]。将受精卵转移至含有M16培养液滴的培养皿中，CO2培养箱内短暂培养。将受精卵转移至含有M16培养液滴的注射用平皿中，覆盖矿物油，准备显微注射。
1.3.5 显微注射
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首先在倒置显微镜低倍镜下找到受精卵，然后转换至200倍下进行显微注射。寻找可以清晰看见两个原核的适合注射的受精卵(图2A)，用持卵针吸住一个卵，将注射针刺入受精卵雄性原核(因雄性原核较大，易注射)，加压将PPARγ2基因溶液注射到受精卵雄性原核，可见原核膨大(图2B)。注射后受精卵CO2培养箱内短暂培养。 商业街www.bizje.com
1.3.6 胚胎移植
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沿受体鼠背部中线，最后一根肋骨水平切1cm左右切口，找到输卵管。将DNA注射完毕后将外观形态良好的受精卵吸入移卵管，解剖镜下将受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部，缝合切口。 一流导航www.16dh.com
1.3.7 转基因小鼠的鉴定 www.Hueiu.com 会友网
约19-21d后受体鼠产下子代仔鼠。取大于3周龄仔鼠尾尖0.5-1cm提取DNA，PCR初步鉴定基因导入情况[67]，筛选出转基因阳性小鼠。 www.Hueiu.com 会友网
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