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窄谱中波紫外线对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mRNA的影响
来源：中国论文下载中心 作者： 发布时间：2008-01-26
【摘要】 目的 研究窄谱中波紫外线(NBUVB)对培养的正常人角质形成细胞(KC)增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HBEGF)mRNA表达的影响。方法 用50mJ/cm2和100mJ/cm2 NBUVB照射正常人KC后继续培养12h，用MTT法和实时荧光定量RTPCR法分别检测KC增殖和HBEGF mRNA的改变。结果 NBUVB照射正常人KC后,可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HBEGF mRNA的表达。50mJ/cm2和100mJ/cm2 NBUVB照射后，分别使KC增殖抑制5.4%和8.7%，使HBEGF mRNA增加到正常对照组的1.7倍和2.5倍。结论 NBUVB抑制KC的增殖部分是通过上调HBEGF的表达介导的。 商业街www.bizje.com
【关键词】 表皮生长因子；角质形成细胞；窄谱中波紫外线 www.07job.com
在亚热带中银屑病少见，并且银屑病有冬重夏轻的特点。这种现象提示温度和日光可能与银屑病的发病有关。自20世纪70年代，临床开始应用补骨脂素长波紫外线(psoralens plus ultraviolet A, PUVA)治疗银屑病、白癜风等皮肤科疾病，之后用中波紫外线(ultraviolet B, UVB)代替UVA。研究发现310nm左右的紫外线对银屑病的治疗效果最佳，红斑效应相对较小。因此，滤除其他波长紫外线所产生的波长在311nm左右的窄谱中波紫外线(narrowband UVB, NBUVB)得以产生并广泛应用于皮肤病的治疗。已证明NBUVB在银屑病的治疗中比普通UVB疗效更好，相同累积剂量下副作用也较小[1]。当前NBUVB光疗已广泛应用于银屑病的治疗，疗效肯定，但其治疗机制尚不完全清楚。 肝素结合表皮生长因子样生长因子(heparinbinding epidermalgrowthfactorlike growth factor, HBEGF)与转化生长因子α(transforming growth factorsα, TGFα)、双向调节因子和表皮调节素等生长因子相互作用，通过旁分泌形式调节角质形成细胞(keratinocyte, KC)的增殖和分化。HBEGF先以跨膜形式(proHBEGF)合成，其外功能区脱落后形成游离形式(sHBEGF)的HBEGF。proHBEGF可抑制细胞的生长，而sHBEGF 是KC、纤维母细胞、平滑肌细胞等多种细胞的有丝分裂原。在表皮增生性皮肤病如银屑病、基底细胞癌、鳞状细胞癌中，HBEGF的表达升高[24]。HBEGF在KC生长和分化的调节中发挥重要的作用。因此，我们在体外用不同剂量的NBUVB照射培养的正常人KC，检测其对细胞增殖和HBEGF mRNA表达的影响。 www.07job.com
1 材料与方法 www.07job.com
1.1 主要仪器和试剂 www.Hueiu.com 会友网
KC无血清培养基(KCSFM)、低糖DMEM、 Dispase酶均购于Gibco公司，依曲替酸(重庆华邦公司)，TRIzol试剂(Invitrogen公司)，RTPCR试剂盒(MBI公司)，SYBR green 2×PCR master mix(ABI公司)，PCR配套试剂(TaKaRa公司)，NBUVB光源(Waldmann, 德国)，Centrifuge 5417R高速低温离心机(Brinkmann Instruments Inc)，GeneAmp PCR system 9700(ABI公司)、PRISM 7900 sequence detector(ABI公司)。
1.2 原代KC的培养
取健康人环切术后包皮，消毒液浸泡后，置于2.5g/L Dispase酶4℃消化过夜，次日分离表、真皮，将表皮置于2.5g/L胰酶与0.02g/L EDTA(1∶1)混合液中，消化10min，用含100mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打后，100目筛网过滤，离心收集细胞，加入KCSFM，吹打后接种入培养瓶，于37℃、50mL/L CO2条件下培养，次日更换新培养基，以后每3d换液一次，当细胞70%-80%融合时传代，取3-5代细胞进行实验[5]。将实验细胞传代入6孔板中，当细胞90%融合时，用PBS冲洗后，覆盖薄层PBS，然后用50mJ/cm2和100mJ/cm2 NBUVB垂直照射KC，照射后换新培养液，继续培养12h，每组设3个孔，并设置未照射的正常对照组。 www.07job.com
1.3 MTT
将处于对数生长期的细胞接种于96孔培养板，用50mJ/cm2和100mJ/cm2 NBUVB垂直照射，继续培养12h。设正常对照组和空白对照组(只加细胞培养液无细胞)。吸出培养液，每孔中加入MTT(5g/L)后再孵育4h，弃上清液后每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡10min。以空白对照组为基准，在490nm波长处检测吸光度值。生长抑制率(%)=1-A490nm(实验组细胞)/A490nm(对照组细胞)×100%。 www.07job.com
1.4 总RNA的提取
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按1mL/10cm2(培养瓶面积)加入TRIzol提取总RNA，操作严格按试剂盒说明进行。用12g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，用紫外分光光度计测定RNA含量和纯度。
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1.5 cDNA的合成
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在反应管中加入2μg总RNA、1μL oLigo(dT)18和1mL/L DEPC处理水至12μL，70℃ 5min，加入5×缓冲液4μL，RNA酶抑制剂20u，10mmoL/L dNTP 2μL，37℃ 5min后，加入MMuLV逆转录酶200u，42℃ 60min，70℃ 10min，冰上冷却，-20℃保存备用。
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1.6 实时荧光定量PCR的检测 大学城www.uniuc.com
用10倍比例稀释βactin基因的PCR扩增产物做相对定量的标准品。βactin基因PCR反应体系为12.5μL，包括：10×PCR buffer 1.25μL，dNTP 0.8μL，上游和下游引物各0.8μL，rTaq 0.08μL，cDNA 2μL，加水至12.5μL。反应条件：94℃ 5min，然后94℃ 30s ，55℃ 30s，72℃ 1min，循环40次，最后72℃ 10min，4℃保存备用。实时定量PCR反应体系为25μL，包括：模板cDNA 2μL，ABI SYBR Green 2×PCR master mix 12.5μL，H2O 1μL，上游和下游引物(βactin或HBEGF)各1μL。扩增条件为：50℃ 2min，95℃ 10min，然后95℃ 30s，60℃ 1min，循环40次。βactin上游引物序列：CAGCACAATGAAGATCAAGATCA，下游引物序列：CGTCATACTCCTGCTTGCTGA，产物125bp；HBEGF上游引物序列：GGCTCCCTCCTGCATCTG，下游引物序列：AGGATGGTTGTGTGGTCATAGGT，产物105bp。在PCR过程中设立无模板阴性对照(no templates control, NTC)。在实验结束后进行溶解曲线分析，以鉴定产物是否单一。 一流导航www.16dh.com
1.7 统计学处理
用2-△△Ct法处理实时荧光定量RTPCR数据，所得结果即表示目的基因相对于正常对照组所改变的倍数[6]。这种方法可把目的基因归一化(normalization)，以减少由于细胞数和抽提RNA获得率的差异所引起的误差，这里ΔΔCt=(CtHBEGF-Ctβactin)实验组-(CtHBEG-Ctβactin)对照组。Ct(threshold cycle, Ct)值，即临介循环数，在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，其与模板cDNA的起始拷贝数成反比。统计学分析采用SPSS11.5软件进行Dunnettt检验，P<0.05认为有统计学意义。结果用±s表示。 www.07job.com
2 结 果 商业街www.bizje.com
2.1 总RNA纯度及质量鉴定
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经测定A260/280比值在1.7-1.9之间，表明RNA无污染，电泳显示5s、18s和28s三条带，说明RNA完整性较好。
2.2 NBUVB对KC增殖的影响
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NBUVB可剂量依赖抑制KC的生长，50mJ/cm2和100mJ/cm2 NBUVB照射后分别使KC的生长抑制5.4%和8.7%(表1)。表1 NBUVB对KC增殖的影响（略） 商业街www.bizje.com
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